廣泛性染色體篩檢(Comprehensive Chromosome Screening, CCS)蓬勃發展，從早期的螢光染色體原位雜交(fluorescent in situ hybridization, FISH)到全染色體晶片檢測(array CGH)。然而螢光染色體原位雜交僅能偵測幾對染色體，全染色體晶片檢測雖能偵測23對染色體，應用於著床前染色體篩檢發現對於低比例鑲嵌偵測能力不佳。而當次世代定序(Next Generation Sequencing, NGS)發展出來，其優點為速度快，成本低，偵測鑲嵌的能力較佳，進而成為市場上的主流。其中被廣泛使用的定序方法學有合成化定序和電位差定序。
PGT-A雙平台比較
本篇主要探討PGT-A檢測平台中，雙平台分別利用自動判讀跟手動判讀結果的一致性為何? 以下列出兩個平台中通量、手做時間、1 run (回) 所需時間以及判讀方法的比較。
| 通量 | 手作時間 | 1 run所需時間 | 判讀 | |
|
Ion S5Ⓡ (Thermo) |
16/24/96 |
WGA+Library(1 step)約5小時 |
約1.5天 | 自動 |
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MiseqⓇ (Illumina) |
24 |
WGA+Library(2 steps)約8小時 |
約1.5天 | 手動 |
實驗設計與流程
實驗設計分為兩個階段，第一階段利用細胞株模擬不同比例的鑲嵌進行敏感性跟特異性的評估，第二階段為臨床檢體測試。
實驗流程如下圖所示：
- 檢體收取後，一同進行前端的Lysis跟Pre-Amplification，接著進行檢體分流。
- 在自動判讀的平台中，接續著Amplification跟barcode結合，放入擁有機械手臂的Chef進行自動化Templating，然後定序，利用軟體進行實驗結果分析，圖中的表格為分析後結果，標示所有染色體CNV與其異常區間。
- 而在手動判讀平台，手做製備Library，放到儀器中進行定序，再利用人為手動判讀。
(灰底為兩者共同，黃底為自動判讀平台，紫底為手動判讀平台。粗框代表自動化)
實驗結果1：細胞株敏感性和特異性評估
第一階段：利用細胞株模擬不同比例的鑲嵌，觀察Copy Number Variation是否有為預期中的趨勢?
(圖1-a)自動化判讀
(圖1-b)手動判讀
接下來利用細胞株評估雙平台的敏感性 (Sensitivity)與特異性(Specificity)。敏感性的定義：偵測到異常的檢體/所有異常檢體 (圖2-a)；特異性的定義：偵測到正常的檢體/所有正常檢體 (圖 2-b)。
結果顯示，雙平台中皆有得到符合預期的趨勢。不管是自動化判讀或是手動判讀，兩者敏感度與特異性相差不大，均沒有達到統計上的差異。
實驗結果2：臨床檢體一致性評估
第二階段為臨床檢體的一致性評估，總共收集了40位受試者，平均年齡37.2 ± 4.3歲，共取到589顆卵子，成熟MII數有514顆，後續受精形成386個受精卵 (2PN)。共送檢108顆囊胚，有1顆未順利放大。首先，利用囊胚的結果比對，再更深入的分析每對染色體的結果，結果如下:
| 自動判讀 | 手動判讀 | |
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測試胚胎數 |
107 | 107 |
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有確定結論的胚胎數 |
104 | 104 |
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無確定結論的胚胎數 |
3 | 3 |
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胚胎檢驗結果 |
||
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正常 |
50 | 49 |
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低比例鑲嵌 |
6 | 11 |
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高比例鑲嵌 |
8 | 9 |
|
異常 |
40 | 35 |
|
結果一致胚胎數 |
103 | |
|
一致率 |
99.04%(103/104) | |
| 自動判讀 | 手動判讀 | |
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染色體對數 |
2392 | 2392 |
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有結果的染色體對數 |
2277 | 2277 |
|
無結果的染色體對數 |
115 | 115 |
|
染色體檢驗結果 |
||
|
二倍體 |
2170 | 2182 |
|
低比例鑲嵌 |
27 | 22 |
|
高比例鑲嵌 |
15 | 15 |
|
異常 |
65 | 58 |
|
結果一致染色體對數 |
2265 | |
|
一致率 |
99.5%(2265/2277) | |
結果顯示，利用囊胚結果比對其一致性為99.0%；若是每對染色體結果分析，一致率為99.5%。
雙平台一致性評估，總結如下：
1. 利用細胞株進行的敏感性跟特異性評估都是差不多，沒有統計上的差異。
2. 不管是分析囊胚結果或是深入探究染色體結果，一致率都是很高的。
3. 也就是說，在PGT-A檢測平台中，不管是自動判讀或是手動判讀都具有高度準確率跟一致性。
藉由PGT-A檢測雙平台的比對，不管是用哪個平台檢測都可得到一致性高的檢測結果。生殖醫學的進步，讓我們利用著床前染色體篩檢加上對的著床時間，排除免疫、血栓因素，懷孕率可高達八成呢！
